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臨床上，病毒的感染需要進(jìn)行診斷，才能提供醫(yī)師治療的依據(jù)、流行病學(xué)的訊息以及病毒感染的防治。病毒的實(shí)驗(yàn)室診斷方法 包括以養(yǎng)殖細(xì)胞分離病毒、組織學(xué)、血清學(xué)、電子顯微鏡觀察、免疫分析以及核酸 (DNA
或 RNA)偵測(cè)等方法[1-2]，操作這些方法前， 須從疑似病毒感染的患者適當(dāng)?shù)牟课粧?cǎi)集各 種檢體，並儘速運(yùn)送至檢驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診 斷[2]。病毒感染的診斷準(zhǔn)確性受到各種因子。
影響:(i)檢體的採(cǎi)檢時(shí)機(jī):檢體通常在癥狀 出現(xiàn)後的 3 天內(nèi)採(cǎi)檢;(ii)採(cǎi)檢部位的選擇: 如呼吸道感染，選擇利用拭子(swab)採(cǎi)集呼 吸道檢體;(iii) 檢體的方式:如採(cǎi)檢體液或 利用拭子採(cǎi)檢後放入無(wú)菌的空容器、小瓶(vi- als)或裝有液體運(yùn)送培養(yǎng)基(transport medium)的容器(如試管);(iv)採(cǎi)檢的拭子的本質(zhì):拭子的材質(zhì)以植絨(flock)材質(zhì)為佳[2-3]，並具 有塑膠或鋁材質(zhì)的硬柄或軟柄，不可使用木 柄的棉棒，因其對(duì)養(yǎng)殖細(xì)胞具有毒性;也不 可使用海藻酸鈣(calcium alginate)成分的拭 子，因其對(duì)含包膜 (envelope) 的病毒具有毒 性、並可干擾螢光抗體試驗(yàn)以及抑制一些核 酸物質(zhì)而影響核酸的分子生物檢測(cè);(v)檢體 的運(yùn)送時(shí)間、儲(chǔ)存環(huán)境以及 (vi) 其它:如採(cǎi)集技術(shù)、採(cǎi)集的檢體量、檢體標(biāo)示以及患者的臨床資訊等[1,3]。有些病毒感染的實(shí)驗(yàn)室診斷是必要的， 例如檢測(cè)會(huì)引起嚴(yán)重癥狀的病毒[如後天免疫 缺 乏 癥 候 群 (acquired immune deficiency syndrome, AIDS)的愛(ài)滋病毒(HIV)]或是長(zhǎng)期 的潛伏的病毒〔如長(zhǎng)期潛伏於肝臟的 B 型肝 炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)和 C 型肝炎 病毒(Hepatitis C virus, HCV)J;或在短時(shí) 間內(nèi)能快速傳播及引起高致死率的病毒，如:2003 年爆發(fā)流行的 SARS 病毒(SARS-CoV)[4]及 2019 年爆發(fā)流行的新型冠狀病毒(SARS- CoV-2, COVID-19 病毒)[5]。此外，已經(jīng)有 藥物可以治療的病毒感染，或?yàn)榱肆餍胁W(xué) 調(diào)查、醫(yī)院感染控制、公共衛(wèi)生如隔離等目 的而進(jìn)行檢體的採(cǎi)集並進(jìn)行各類病毒的檢測(cè)。 病毒檢測(cè)檢體除了體液〔如支氣管肺泡 灌洗(BAL)、腦脊髓液(CSF)、尿、血液J外， 若以拭子採(cǎi)集的檢體需放入空的無(wú)菌容器或 含有運(yùn)送培養(yǎng)基的容器內(nèi)，立即以適當(dāng)?shù)臈l件送至檢驗(yàn)室或儲(chǔ)存在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境一段時(shí)間再送至檢驗(yàn)室。因此，病毒檢測(cè)檢體中的抗 原、活性、病毒量與核酸將受到拭子的本質(zhì)、運(yùn)送培養(yǎng)基的成分、運(yùn)送的條件、儲(chǔ)存的時(shí) 間與環(huán)境等之影響[1,3]。為了保存病毒的活性 以及核酸，檢驗(yàn)室有必要使用良好品質(zhì)與材 質(zhì)的拭子以及適當(dāng)?shù)臋z體運(yùn)送培養(yǎng)基種類。
對(duì)少數(shù)引起嚴(yán)重疾病的病毒而言，檢測(cè) 病毒必須在 P2+或 P3 甚至 P4 等級(jí)的負(fù)壓實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，以 SARS-CoV 及 SARS-CoV-2而言，更是如此。然而，有此些安全等級(jí)的 實(shí)驗(yàn)室在醫(yī)院中並不普遍，因此，對(duì)高傳染 性的病毒而言，整體的檢驗(yàn)?zāi)芰繉⑹艿较拗啤?在 SARS-CoV-2 疫情期間，增加全國(guó)的檢測(cè) 能量以早期偵測(cè)感染或潛伏的患者將有其重 要性及必要性。對(duì)不進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)而僅 提供核酸擴(kuò)增試驗(yàn)的檢驗(yàn)室而言，只要檢測(cè) 檢體先經(jīng)去活化 (inactivate，滅活)處理，則
檢測(cè)的場(chǎng)所僅需在 P2 等級(jí)的實(shí)驗(yàn)室即可進(jìn)行操作，如此，將可擴(kuò)展全國(guó)對(duì) SARS-CoV-2病毒的整體檢測(cè)能量。
在臺(tái)灣，具有病毒檢測(cè)能力的檢驗(yàn)室雖 有能力配製一般病毒檢體的運(yùn)送培養(yǎng)基，但 其使用前大多未進(jìn)行實(shí)用的效能評(píng)估或進(jìn)行 效能的品管，且常沒(méi)有使用正確材質(zhì)成分的 拭子，有鑑於此，做新生物科技公司開(kāi)發(fā)兩 種病毒檢測(cè)檢體的運(yùn)送裝置:一為 CMPTM 病 毒運(yùn)送保存管[viral transport medium (VTM)]，另一為 CMPTM 去活化型病毒運(yùn)送保存管[in- activated viral transport medium (I-VTM)](圖 1A)，兩者皆可搭配鼻咽及/或口咽植 絨拭子(flocked swab)。植絨拭子皆具有斷點(diǎn) (圖 1B)，可將拭子前端折進(jìn)運(yùn)送管內(nèi)。為 了瞭解 VTM 與 I-VTM 輔助病毒(包含 SARA- CoV-2)偵測(cè)的效能，有必要以適當(dāng)?shù)牟《?進(jìn)行實(shí)用性評(píng)估。
早期，對(duì)於運(yùn)送檢體裝置的病毒回收率 並沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)的方法，只有少數(shù)的研究從臨床上取得的檢體，經(jīng)由不同運(yùn)送裝置來(lái)比較病毒的回收率;或是添加某種病毒檢體至運(yùn)送 裝置，檢視回收率。為了將運(yùn)送培養(yǎng)裝置的評(píng)估加以標(biāo)準(zhǔn)化，Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M40-A2[6]提出明 確規(guī)範(fàn)，包括病毒檢體的種類、運(yùn)輸時(shí)間、 保存溫度及病毒接種濃度上限範(fàn)間。在規(guī)範(fàn) 中，將裝置保存在指定溫度，模擬運(yùn)輸時(shí)間 (24、48、72 及 96 小時(shí))，再分別製備十倍連續(xù)稀釋液，吸取 0.2 mL 接種至養(yǎng)殖細(xì)胞中，若產(chǎn)生細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effects, CPE)，代表病毒具有活性，即運(yùn)送裝置保存 病毒的性能符合規(guī)範(fàn)之要求。
本研究將根據(jù) CLSI 建議選用第二級(jí)病毒[6]之一的腸病毒 71 型(Entrovirus 71, EV 71)進(jìn)行測(cè)試，EV 71 屬於微小核糖核酸病毒科 (Picornaviridae)，不具包模(envelope)的單股 正股 RNA 病毒，由於不具包膜，對(duì)於環(huán)境的耐受力較高[7]，且其與冠狀病毒科(Coronavi-ridae)中的 SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 皆屬 於 RNA 病毒[4-5]。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將 EV 71 分別與 VTM 或 I-VTM 兩種運(yùn)送培養(yǎng)基混合，保存於 三種溫度，然後於不同指定時(shí)間後，分別接 種至人類橫紋肌肉瘤細(xì)胞(human rhabdomyos- arcoma cell , RD 細(xì)胞)中，之後觀察 CPE 及利用反轉(zhuǎn)錄-即時(shí)聚合醋鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)偵測(cè) RD 細(xì)胞內(nèi) EV 71 之正股及負(fù)股 RNA，其中細(xì)胞內(nèi)正股 RNA 代表 EV 71 成功感染細(xì)胞，而細(xì)胞內(nèi)負(fù)股 RNA 則為 EV 71 複製其 RNA 的中 間產(chǎn)物，可間接證明 EV 71 於 RD 細(xì)胞內(nèi)複 製。另外，本研究利用 SARS-CoV-2 的三對(duì) 基因[8-9]分別與 VTM 或 I-VTM 混合，亦進(jìn)行 如同 EV 71 在不同保存溫度及時(shí)間條件下的 qRT-PCR 檢測(cè)，以了解此 VTM 及 I-VTM 保 存 SARS-CoV-2 核酸的能力。
非洲綠瀰猴腎細(xì)胞株 (vero cell line, ATCC CCL-81)及 EV 71 (BrCr, ATCC VR784)均購(gòu)自食品工業(yè)發(fā)展研究所，臺(tái)灣。SARS-CoV-2 的三對(duì)引子(primers)基因片段 (E gene、RdRp gene 及 N gene)，購(gòu)自 MicroBioLogics?(型 號(hào): HE0062S)，USA。試劑與藥品一倍基本培養(yǎng)液 (1x minimal essential medium, MEM)與抗生素(antibiotic-antimycin, 內(nèi)含 penicillin、streptomycin、amphotericin B)購(gòu)自 Corning Incorporated 公司，美國(guó)。胎 牛血清(fetal bovine serum, FBS)、膜蛋白酵 素(Trypsin)與一倍磷酸鹽緩衝液(1x phosphate buffer saline, PBS)來(lái)自 GE Healthcare 公司， 美國(guó)。甘油(Glycerol)、氯仿(chloroform)、 75% 酒精 (EtOH)、異丙醇 (isopropanol) 與 DEPC (diethylpyrocarbonate)處理水從 Merck 公司(德國(guó))取得。螢光定量試劑盒(FastStart Universal SYBR Green Master)則購(gòu)自 Roche 公司，瑞士。而 cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (High- Capacity cDNA Reverse Transcription Kit)及 trizol(分離 RNA、DNA、蛋白質(zhì)的試劑) 則來(lái)自 Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó)。
細(xì)胞培養(yǎng)液配製(10% MEM、2% MEM)取總體積 10%的 FBS 及 1%的抗生素的 加入 1x MEM，此為生長(zhǎng)培養(yǎng)液(10% MEM)， 存放於 4C用於細(xì)胞繼代及培養(yǎng)。取總體積 2%的 FBS 及 1%的抗生素加入 1x MEM，此 為維持培養(yǎng)液(2% MEM)，存放於 4C用於稀 釋藥物及維持受病毒感染的細(xì)胞株。FBS 使 用前需在 56C水浴槽加熱 30 分鐘，去除血 清中補(bǔ)體，分裝後保存於-20C備用。將 10x PBS 利用去離子蒸餾水 (double-distilled H2O, ddH2O) 稀釋成 1x PBS，再經(jīng)滅菌冷卻後存 放於 4C備用。此外，glycerol 則以 ddH2O 稀 釋成 30% glycerol，再經(jīng)滅菌冷卻後，存放於 4C備用。
RD 細(xì)胞培養(yǎng)/繼代培養(yǎng)
RD 細(xì)胞於培養(yǎng)瓶中生長(zhǎng)至 80%時(shí)，進(jìn) 行繼代培養(yǎng)。在無(wú)菌操作箱(型號(hào):Revcoeite II)中，將經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的 T25 培養(yǎng)瓶(購(gòu)自 Corning Incorporated 公司，美國(guó))以 3 mL 1x PBS 潤(rùn)洗後去除培養(yǎng)液，接著加入 0.5 mL Trypsin， 混合均勻後置入 37C之 5% CO2 培養(yǎng)箱中放 置 1 分鐘，取出培養(yǎng)瓶後以拍擊方式震散細(xì) 胞，然後加入 4.5 mL 10% MEM 以中和 Trypsin 的繼續(xù)作用，將 RD 細(xì)胞沖下並均勻 打散，接著將細(xì)胞與 10% MEM 以 1:4 至 1:9 的比例回種到新的細(xì)胞培養(yǎng)血中，置於 37C 之 5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
EV 71 之溶斑試驗(yàn)
利用溶斑試驗(yàn)(plaque assay)測(cè)定 EV 71 濃度，實(shí)驗(yàn)時(shí)，將 RD 細(xì)胞培養(yǎng)於 6 孔細(xì)胞 培養(yǎng)盤中，之後以 2% MEM 將待測(cè)病毒液進(jìn) 行連續(xù) 10 倍稀釋後 (10-2-10-6)進(jìn)行感染，其 中 1 孔為不加病毒液之陰性控制組，將細(xì)胞 置於 37C的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 1 小時(shí)進(jìn)行感 染。
於感染的過(guò)程中，配製等體積的 1.2%瓊 脂溶液與 2x 培養(yǎng)液，置於 44C水浴中。待病 毒感染完成後去除病毒液，將等體積之 1.2% 瓊脂溶液與 2x 培養(yǎng)液均勻混合後，分別於培 養(yǎng)盤中每一孔緩慢加入 4 mL 瓊脂培養(yǎng)液，待凝固後，置於 37C的 5% CO2 培養(yǎng)箱中，於3 天後加入第二層瓊脂，然後繼續(xù)培養(yǎng)。
當(dāng)產(chǎn)生明顯 CPE 時(shí)(通常於感染後第 5 天)，於每培養(yǎng)盤中每孔加入 1 ml 3.7%甲 醒，於 4C固定。隔天輕輕敲除 6 孔盤中的 瓊脂培養(yǎng)基，並加入 2-3 滴的 0.5%結(jié)晶紫，染色 5 分鐘後，以清水沖洗乾淨(jìng)。當(dāng)培養(yǎng)盤完全乾燥後，受到 EV 71 感染的 RD 細(xì)胞由 於死亡脫落而無(wú)法被染上色，形成肉眼可見(jiàn)的空洞，稱為溶斑(plaque)。藉由感染不同稀 釋倍數(shù)的病毒液所造成的溶斑數(shù)目推算原始 病毒的效價(jià) (titer)，單位為 plaque forming unit (PFU)/mL，代表每 mL 病毒液可產(chǎn)生的 病毒溶斑數(shù)目。
EV 71 RNA 之萃取
將 1.5 mL 含有 EV 71 的培養(yǎng)液於 4C下1,000 rpm，離心 5 分鐘，將上清液去除後加 入 1 mL 的 trizol 將沉澱物打散，將混合液移 至另一個(gè) 1.5 mL 微量離心管中，於室溫靜置 5 分鐘，接著加入 200 μL chloroform，利用 振盪器(vortex genie 2)震盪 1 分鐘，直至溶 液顏色變成粉紅色後，然後再於室溫靜置 2-3 分鐘。將離心管於 4C，12,000 rpm 離心 15
分鐘後，小心吸取上層含 RNA 之透明液(至少 450 μL)移至新的 1.5 mL 微量離心管中， 然後加入 0.5 mL isopropanol 後，上下?lián)u晃 約 10 次，將溶液混合均勻後，靜置於室溫 10 分鐘，接著將離心管於 4C，12,000 rpm 離 心 10 分鐘後去除上清液後，再加入 1 mL 的 75% EtOH 於 4C，12,000 rpm 離心 10 分鐘 後小心去除上清液，將白色沉澱物(pellet)風(fēng) 乾至半透明後加入 20 μL DEPC 處理水回溶 沉澱物，將樣本置於冰上以測(cè)定 EV 71 濃度。
反轉(zhuǎn)錄-即時(shí)眾合 鏈反應(yīng)(quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR)反轉(zhuǎn)錄
PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)[9]:
將萃取出之 EV 71 RNA 以 20μL DEPC 處理水 20 倍稀釋，使用超微量分 光光度計(jì)(ND-1000, NanoDrop Spectrophotometer) 測(cè)量其濃度。然後根據(jù)測(cè)得的濃度，加入 1 μg 濃度 RNA、2 μL 10x RT buffer、0.8 μL 25x dNTP Mix (100 mM)、2 μL 10x RTrandom primers、1 μL MultiScribeTM reverse transcriptase 及 1 μL RNase inhibitor 之後補(bǔ)ddH2O 至總體積 20 μL，再以 25C保持 10 分鐘、37C保持 120 分鐘、最後 85C保持 5 分 鐘的順序循環(huán) 1 次，進(jìn)行 RT-PCR。
qPCR 之操作流程[10]:將萃取出的 EV 71 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合醋鏈反應(yīng)，得到的 cDNA 後進(jìn)行 qRT-PCR 檢測(cè)。取 5 μL cDNA、0.5 μL Forward primer (30 M)、0.5 μL Reverse primer (30 M)、25 μL FastStart Universal SYBR Green Master 及 19 μL ddH2O 置 入 StepOnePlusTM real-time-PCR 儀 器 (Thermo Fisher Scientific 公司，美國(guó))中 擴(kuò)增 40 次進(jìn)行量測(cè)，利用 StepOnePlusTM 之 內(nèi)建軟體進(jìn)行螢光偵測(cè)，再將偵測(cè)到的訊號(hào) 轉(zhuǎn)換為數(shù)值，並以 GAPDH 為內(nèi)部控制組， 將各組待測(cè)基因之 CT 值標(biāo)準(zhǔn)化以取得企CT 值，而後實(shí)驗(yàn)組扣除控制組之企CT 值，得到企企CT。2-企企CT 則可表示不同組別之待測(cè)基因與控制組之基因相對(duì)表現(xiàn)量。
Primer: EV 71 RNA Positive strand
F: (GAGAGTTCTATAGGGGACAGT)
R: (AGCTGTGCTATGTGAATTAGGAA) Negative strand
F: (ACTGTCCCCTATAGAACTCTC)
R: (TTCCTAATTCACATAGCACAGCT)
VTM 與 I-VTM 的效能評(píng)估
效能評(píng)估時(shí)，將 EV 71 分別與 VTM 或 I- VTM 混合，然後保存在 3 種溫度，在不同保 存時(shí)間後接種 RD 細(xì)胞， 觀察 EV 71 的活性 (有能力產(chǎn)生 CPE)以及偵測(cè)核酸的存在(能被 qRT-PCR 方法檢出)。根據(jù) CLSI M40-A2 建 議的病毒檢體運(yùn)送裝置評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[6]，本研究使 用的 EV 71 原液濃度為 1x106 PFU/mL，在 保存型 VTM 組別中將培養(yǎng)基中病毒濃度稀釋 至 2x105 PFU/mL，取 0.2 mL 病毒加入 2 mL VTM 中(約 1.8x104 PFU/mL);另外 I-VTM 組別，取 50 L 病毒與 50 L I-VTM 混合後 放入離心管中 (約 5x105 PFU/mL)。個(gè)別在4C、-80C及室溫存放。由於在臺(tái)灣，交通 運(yùn)送便利且距離較近，病毒檢體運(yùn)送時(shí)間短， 且通常存放在 4C。所以在 4C組別中增加 6 小時(shí)及 24 小時(shí)兩個(gè)組別，以模擬病毒檢體實(shí) 際運(yùn)送狀況。保存在 4C分為 6、24、48、72 及 96 小時(shí)共 5 組，而保存在-80C及室溫為48、72 及 96 小時(shí)共 3 組。此外，為了確認(rèn) I-VTM 裂解病毒的能力，額外將 EV 71 接種於 I-VTM 中存放 10 分鐘、30 分鐘、1、2、3 及 4 小時(shí)，然後接種 RD 細(xì)胞並觀察 CPE。
當(dāng) EV 71 接種至 VTM 存放至預(yù)設(shè)的時(shí) 間點(diǎn)後，VTM 組別分別取 0.2 mL(約 103 PFU)接種至 RD 細(xì)胞中，再加入 0.2 mL 2% MEM 進(jìn)行混合，而 I-VTM 組別則取 40 L， 加至 9.96 mL 2% MEM，稀釋後(約 2x103PFU/mL)取 1 mL(約 2x103 PFU)接種至RD 細(xì)胞中。隨後，將接種 EV 71 的 VTM 及I-VTM 組別分別放置於 37C之 5% CO2 培養(yǎng) 箱培養(yǎng)中，1 小時(shí)後，移除細(xì)胞培養(yǎng)液，以 1x PBS 潤(rùn)洗過(guò)後，再加入 2% MEM，然後 分別培養(yǎng) 48 及 72 小時(shí)，最後以倒立式顯微 鏡觀察 CPE。同時(shí)，將只加入 VTM 或 I-VTM 作為保存液之 RD 細(xì)胞及含有 2% MEM 的 RD 細(xì)胞分別作為陰性控制組。培養(yǎng)至指定時(shí)間 後，分別觀察 RD 細(xì)胞的 CPE 及操作 qRT- PCR 以分析 VTM 或 I-VTM 的效能。
VTM 或 I-VTM 保存 EV 71 與 SARS-CoV-2
核酸的測(cè)試
為了確認(rèn) EV 71 與 SARS-CoV-2 的 RNA 可以直接保存在 VTM/I-VTM 中，本研究分 別取 1 L EV 71 (1x106 PFU/mL) 加至 1 mL VTM 或 I-VTM 中(約 1x103 PFU/mL)，以及取 10 uL SARS-CoV-2 檢測(cè)所用的 E、 RdRp 及 N 基因片段之混和庫(kù)存液(mix stock)，分別保存在 4C、-80C及室溫，然後存放至24 及 96 小時(shí)，最後再抽取兩種病毒之核酸進(jìn)行 qPCR 檢測(cè)。
結(jié) 果
在不同溫度及時(shí)間下 VTM 保存 EV 71 活性與 核酸的狀況
本研究將 EV 71 保存於 VTM 中，然後 於特定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)移種至 RD 細(xì)胞中進(jìn)行培 養(yǎng)，經(jīng)過(guò) 72 小時(shí)後觀察細(xì)胞形態(tài)，並與未接 種 EV 71 之 RD 細(xì)胞進(jìn)行比較。相較於控制 組，無(wú)論在 4C、室溫及-80C，RD 細(xì)胞皆 呈現(xiàn)皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、凝聚、和脫落 等現(xiàn)象(圖 2A)，此結(jié)果顯示 RD 細(xì)胞發(fā)生 CPE(表 1)，代表 EV 71 具有活性。另外， qRT-PCR 檢測(cè) RD 細(xì)胞內(nèi) EV 71 之正股與負(fù) 股 RNA 片段，結(jié)果皆呈現(xiàn)陽(yáng)性(表 1)，此 指出 VTM 可良好保存病毒之核酸。
在不同溫度及時(shí)間下 I-VTM 去除 EV 71 活性 與保存 EV 71 核酸的狀況
本研究將 EV 71 保存於 VTM 中，然後 於特定的時(shí)間點(diǎn)時(shí)移種至 RD 細(xì)胞中進(jìn)行培 養(yǎng)，經(jīng)過(guò) 72 小時(shí)後觀察細(xì)胞形態(tài)，並與未接 種 EV 71 之 RD 細(xì)胞進(jìn)行比較。結(jié)果顯示在 4C、室溫及-80C細(xì)胞皆無(wú) CPE(圖 2B)。 同時(shí)利用 qRT-PCR 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi) EV 71 正股及
負(fù)股 RNA 片段，觀察細(xì)胞內(nèi)病毒核酸保存情形，結(jié)果皆呈現(xiàn)陰性(表 1)，顯示 I-VTM 可以去除病毒活性(感染力)。同時(shí)觀察將 EV 71 保存於 I-VTM 中於三種不同時(shí)間點(diǎn) (4C、 室溫及 -80C)保存 10 分鐘、30 分 鐘、1、2、3 及 4 小時(shí)，結(jié)果顯示 4C及室溫 於 2 個(gè)小時(shí)可以完全去除 EV 71，而-80C僅 需 30 分鐘即可(表 2 與圖 3)。
VTM/I-VTM 在不同溫度及時(shí)間下保存 EV 71及 COVI-19 病毒核酸的狀況
在臨床檢驗(yàn)中，由於檢體採(cǎi)集包含組織、 疲液、血液及糞便等不同樣本，為了確保 VTM 及 I-VTM 能直接保存核酸樣本，將 EV 71 與 SARS-CoV-2 檢測(cè)所用的 E、RdRp 及 N基因片段加入 VTM 及 I-VTM 中於 4C、室 溫及-80C各別保存 24 及 96 小時(shí)，利用 qRT- PCR 檢測(cè) EV 71 核酸及 SARS-CoV-2 基因的 訊號(hào)。結(jié)果顯示 VTM 及 I-VTM 至少可保存 病毒核酸至 96 小時(shí)(表 3)。
討 論
自患者檢體中分離病毒的方法為病毒疾 病診斷法之一。含有液體的檢體，例如腦脊 髓液、尿液、及糞便檢體可直接置於無(wú)菌的 容器中送到病毒檢驗(yàn)室。必須以拭子採(cǎi)集的 檢體如喉嚨、鼻咽、直腸等，則須將採(cǎi)集檢 體後的拭子立刻放入無(wú)菌的運(yùn)送培養(yǎng)基中。 病毒檢體運(yùn)送培養(yǎng)基至少具有三個(gè)功能[11]: (i)提供給水分，防止乾燥將病毒去活化(inac- tivated)。(ii) 含 有 蛋 白 質(zhì) 穩(wěn) 定 劑 (protein stabilizer) 以保持拭子上病毒的活性。以及 (iii)含有抗生素而可抑制採(cǎi)檢時(shí)受到採(cǎi)檢部 位棲息細(xì)菌和其菌的汙染。無(wú)論是否使用運(yùn) 送培養(yǎng)基裝置，所有的檢體須立刻送到檢驗(yàn) 室，因?yàn)椴《驹诨罴?xì)胞外十分不穩(wěn)定。
冠狀病毒中 SARS-CoV 與 SARS-CoV-2 都是屬於傳染力極強(qiáng)的飛沫傳染病毒，感染 者都會(huì)伴隨著嚴(yán)重的呼吸道癥狀及高致死率 前者於 2002-2003 共造成全球 8,096 例感染， 其中 774 例死亡，致死率為 9.56%;而後者 於 2019-2020/9 月中共造成全球 3,131 萬(wàn)人感 染，其中 96.6 萬(wàn)人死亡，致死率為 3.09% [12]，且兩種病毒有最長(zhǎng) 10 及 14 天的高感染 力潛伏期。面對(duì)傳播如此快速又高致死率的 病毒，臨床上有效且安全地篩檢 COVID-19 確診患者將是一項(xiàng)重大的考驗(yàn)。
病毒的聚合醋 鏈反應(yīng) (PCR)檢測(cè)，不能 含有外來(lái)的 DNA/RNA 及 DNases/RNases， 但棉拭和海藻酸鹽棉拭均存在這些醋，將會(huì) 抑制 PCR 反應(yīng)[3]。VTM 或 I-VTM 所附帶的 拭子均為植絨的吸頭，其為聚瞌胺的一種， 植絨纖維束間的毛細(xì)管作用促進(jìn)了液體樣品
(A) CMPTM 病毒運(yùn)送保存管[viral transport medium (VTM，左方橘色培養(yǎng)液)]與 CMPTM 去活化型病毒運(yùn)送保存 管[inactivated viral transport medium (I-VTM，右方透明培養(yǎng)液)]，兩者皆可搭配鼻咽及/或口咽植絨拭子(flocked swab);(B)由上到下分別為 nasopharyngeal flocked swab(鼻咽植絨拭子)、oropharyngeal flocked swab(口咽植 絨拭子)及一般人造絲棉棒。植絨拭子皆具有斷點(diǎn)(紅色箭頭處)，可將拭子前端折進(jìn)運(yùn)送管內(nèi)。
表 1. EV 71 分別接種於 VTM 或 I-VTM 中在不同溫度及儲(chǔ)存時(shí)間下對(duì) RD 細(xì)胞產(chǎn)生 CPE 及 RD
細(xì)胞內(nèi)核酸檢測(cè)結(jié)果
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于存溫度/于存時(shí)間 |
Control(控制組) |
4C |
RT |
-80C |
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Medium only |
EV 71 only |
6 hr |
24 hr |
48 hr |
72 hr |
96 hr |
48 hr |
72 hr |
96 hr |
48 hr |
72 hr |
96 hr |
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測(cè)試產(chǎn)品 |
VTM |
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CPEa |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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Positive strandb |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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Negative strandC |
- |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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測(cè)試產(chǎn)品 |
I-VTM |
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CPEa |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
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Positive strandb |
- |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
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- |
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Negative strandC |
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+ |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
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- |
- |
- |
aCPE: +，代表 RD 細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變 (CPE); -，代表 RD 細(xì)胞無(wú) CPE;bPositive strand: +，表示樣品中含有 EV 71 顆粒。-， 表示樣品中無(wú) EV 71 顆粒;CNegative strand: +，代表 EV 71 核酸進(jìn)行複製; -，代表 EV 71 核酸無(wú)進(jìn)行複製。 縮寫:VTM，病毒運(yùn)送保存管;I-VTM 去活化型病毒運(yùn)送保存管;RT，室溫。
的強(qiáng)力吸收，且將樣品吸附在靠近表面的位 置，因此，易再溶於液體中。因此，植絨拭 子可有效收集和釋放包括細(xì)胞在內(nèi)的顆粒物 [13]，適合採(cǎi)檢含有病毒的檢體[1-3]。適當(dāng)?shù)倪\(yùn) 送培養(yǎng)基的組成對(duì)保護(hù)檢體中病毒免受環(huán)境損傷，維持病毒活性極其重要[11]。實(shí)際上，病毒的傳染性會(huì)隨著時(shí)間的流逝而降低，且衰減率通常與于存溫度有關(guān)[14]，藉由冷藏可 維持其核酸穩(wěn)定性。採(cǎi)集含有較多病毒顆粒 的細(xì)胞培養(yǎng)物及縮短病毒檢體的運(yùn)送與接種 時(shí)間，將會(huì)增加成功分離病毒的可能性，此 對(duì)高危險(xiǎn)性傳染病毒的精準(zhǔn)診斷將有所助益。
本研究將 EV 71 保存於 VTM 中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無(wú)論是 4C、室溫及-80C保存於指定時(shí)間點(diǎn)
圖 2. EV 71 分別接種於 VTM 或 I-VTM 中在不同溫度及時(shí)間財(cái)存後戚染 RD 細(xì)胞所顯示的細(xì)胞形態(tài)
圖中包括含陽(yáng)性控制組(PC: virus)、陰性控制組(NC: medium)與實(shí)驗(yàn)組(4C、RT 及-80C)之細(xì)胞形態(tài)。顯微鏡 (200x)觀察。(A) VTM 的陰性控制組顯示細(xì)胞完整，無(wú)細(xì)胞病變(CPE);陽(yáng)性控制組與實(shí)驗(yàn)組在所有溫度及時(shí)間下 皆發(fā)現(xiàn) CPE:細(xì)胞呈現(xiàn)皺縮、變圓、出現(xiàn)空泡、凝聚、和脫落等現(xiàn)象(箭頭)。(B) I-VTM 的陰性控制組與實(shí)驗(yàn)組 細(xì)胞皆無(wú) CPE，而陽(yáng)性控制組則有 CPE。
縮寫:VTM，病毒運(yùn)送保存管;I-VTM 去活化型病毒運(yùn)送保存管;RT，室溫。
後(最久 96 小時(shí))接種於 RD 細(xì)胞，結(jié)果顯 示 RD 細(xì)胞皆呈現(xiàn) CPE;此外，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)正股及負(fù)股 RNA 亦皆呈現(xiàn)陽(yáng)性，顯示 VTM 可
以良好保存病毒活性(表 1 和圖 2A)。當(dāng) EV 71 保存於 I-VTM 中，無(wú)論是 4C、室溫及-80C 保存於指定時(shí)間點(diǎn)後接種於 RD 細(xì)胞，結(jié)果顯 示細(xì)胞皆無(wú)呈現(xiàn) CPE，細(xì)胞內(nèi)的 EV 71 正股及 負(fù)股 RNA 亦皆呈現(xiàn)陰性(表 1 與圖 2B)，此 指出 EV 71 喪失活性。另外研究亦指出 I-VTM 可於 2 小時(shí)完整的去除 EV 71 活性(表 2 和圖 3)。此外，將 EV 71 與 SARS-CoV-2 的片段
表 2. 接種 EV 71 於 I-VTM 在不同溫度下時(shí) 存不同時(shí)間裂解病毒(不產(chǎn)生 CPE)的效能
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時(shí)間 溫度 |
10 min |
30 min |
1 hr |
2 hr |
3 hr |
4 hr |
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4C |
+* |
+ |
+ |
- |
- |
- |
|
RT |
+ |
+ |
+ |
- |
- |
- |
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-80C |
+ |
- |
- |
- |
- |
- |
*+，表示接種到 RD 細(xì)胞後於 72 小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)細(xì)胞病變
(CPE);-，表示未出現(xiàn) CPE。
縮寫:I-VTM 去活化型病毒運(yùn)送保存管;RT，室溫。
圖 3. 接種 EV 71 於 I-VTM 中儲(chǔ)存不同溫度 及不同時(shí)間後分別移種 RD 細(xì)胞所顯示 EV 71 不產(chǎn)生 CPE(喪失活性)的情形
圖中包括含陽(yáng)性控制組 (PC: virus)、陰性控制組 (NC: medium)與實(shí)驗(yàn)組 (4C、RT 及-80C)之細(xì)胞形態(tài)。顯 微鏡 (200x)觀察，箭頭代表產(chǎn)生 CPE 細(xì)胞。結(jié)果顯示 控制組細(xì)胞完整無(wú) CPE，而實(shí)驗(yàn)組中于存在-80C，1 小時(shí)後以及于存在 4C及 RT(室溫)，2 小時(shí)後完全 無(wú) CPE(代表 EV 71 喪失活性)。
縮寫:I-VTM 去活化型病毒運(yùn)送保存管;RT，室溫。
表 3. VTM 與 I-VTM 在不同溫度下保存 EV 71 及 SARS-CoV 2 核酸情形
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時(shí)間
溫度 |
EV 71 RNA |
SARS-CoV 2 基因片段 (E gene、RdRp gene 及 N gene) |
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VTM |
I-VTM |
VTM |
I-VTM |
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4C |
24 hr |
96 hr |
24 hr |
96 hr |
24 hr |
96 hr |
24 hr |
96 hr |
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4C |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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RT |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
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-80C |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+ |
+，表示樣品中含 EV 71 或 SARS-CoV-2 核酸，可被 qRT-PCR 檢出。
縮寫:VTM，病毒運(yùn)送保存管;I-VTM 去活化型病毒運(yùn)送保存管;RT，室溫。
基因直接加入 VTM/I-VTM 中於 4C、室溫 及-80C保存 24 及 96 小時(shí)，然後進(jìn)行兩種病 毒的核酸偵測(cè)，結(jié)果皆為陽(yáng)性，指出 VTM/I-
VTM 皆可完整保存病毒的核酸(表 3)。
上述結(jié)果顯示 VTM 或 I-VTM 不論在 4C、室溫及-80C皆可以在指定時(shí)間內(nèi)有效 保存病毒的可檢測(cè)性，其中 VTM 為保存型 運(yùn)送管，可以完整保存病毒的活性，以利後續(xù)的體外活體細(xì)胞培養(yǎng)、抗原檢測(cè)、核酸檢測(cè).等鑑定及研究用途，而 I-VTM 的特點(diǎn)則 在於運(yùn)送過(guò)程中(2 小時(shí))即可裂解病毒顆 粒，僅保存核酸供作核酸檢測(cè)，而不具感染 能力，其設(shè)計(jì)目的為增加臨床第一線檢測(cè)人 員的安全，降低感染風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)本研究所獲 得的數(shù)據(jù)顯示，做新生物科技有限公司生產(chǎn) 的 VTM 及 I-VTM 可做為臨床檢驗(yàn)室選用病 毒檢體運(yùn)送裝置的參考。
